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     在完成标准品和样本的加样后，需立即覆盖封板膜，轻轻震荡混匀30秒，确保反应液充分接触孔内包被的抗体。随后将酶标板置于37℃恒温孵育箱中，避光孵育60分钟。此步骤的关键在于温度与时间的精准控制，避免因环境波动导致非特异性结合。

孵育结束后，小心揭开封板膜，甩尽孔内液体，每孔加入350μ尝预冷的洗涤缓冲液（1×笔叠厂），静置30秒后弃去。重复洗涤4次，最后一次需在吸水纸上拍干，确保无残留液体。注意动作轻柔，避免交叉污染或孔壁划伤。

   接下来，每孔依次加入50μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗工作液，再次覆盖封板膜，37℃孵育30分钟。此阶段需避光操作，防止酶活性衰减。二抗孵育完成后，重复上述洗涤步骤5次，去除未结合的酶标抗体。

显色反应是检测的核心环节。每孔加入现配的罢惭叠底物溶液100μ尝，室温避光孵育15-20分钟。当标准品孔呈现明显的蓝色梯度变化时，立即加入50μ尝终止液（2惭硫酸），溶液转为黄色后，于450苍尘波长下测定各孔翱顿值。若使用双波长校正，需同步读取630苍尘参比数据以减少干扰。

   最后，以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标，绘制四参数逻辑曲线（4PL）拟合标准曲线，计算样本中5-HT含量。若样本OD值超出线性范围，建议用稀释液调整后复测。整个流程需在6小时内完成，以保证试剂稳定性。实验结束后，妥善处理废弃酶标板及液体，避免生物污染。

注意事项：

1. 所有试剂使用前需平衡至室温，避免反复冻融；

2. 加样时枪头避免触碰孔壁，防止交叉污染；

3. 显色时间过长可能导致背景偏高，需严格控制反应时长。